Работа с образцами крови

Сбор образцов

Кровь для гематологического исследования должна быть собрана в пробирку с антикоагулянтом, предпочтительно EDTA (фиолетовый колпачок пробирки).

Мазки крови должны быть сделаны в момент сбора для минимизации изменений в клетках. Венепункция должна быть минимально травматичной для минимизации активации тромбоцитов и должна быть сделана с использованием, как минимум, 23G иглы (21-22G идеально подходит для небольших животных и 18G идеально подходит для крупных животных) и 3-5 мл шприца (в зависимости от желаемого объема). Также можно использовать вакутейнеры (вакуумные пробирки для сбора венозной крови).

Образцы крови от очень маленьких или педиатрических пациентов могут быть помещены в микротейнеры (пробирки для капиллярной крови). Вне зависимости от пробирки, используемой для сбора проб, кровь должна быть адекватно смешана с антикоагулянтом во время и после сбора, чтобы предотвратить свертывание. Это делается путем осторожного переворачивания пробирки (но никогда не встряхивать).

Главные принципы обработки

Все образцы должны храниться в прохладном месте (при пониженных температурах, но не замороженными) во время хранения и транспортировки, чтобы свести к минимуму изменения в клетках, которые могут возникнуть при хранении. Образцы должны быть обернуты в бумажные полотенца, чтобы предотвратить прямой контакт пробирки со льдом, что привело бы к замораживанию и лизису красных и белых кровяных клеток в пробирке. Кроме того, мазки должны быть сделаны из свежесобранной крови и быть приложенными к пробиркам, чтобы помочь облегчить исследование мазка крови и обеспечить предоставление наиболее точных результатов. Кровь в пробирке должна быть холодной, однако мазки должны храниться и транспортироваться при комнатной температуре.

Следующие антикоагулянты могут быть использованы для гематологического исследования:

• ЭДТА: в этом антикоагулянте клетки сохраняются оптимально, т.к. хелаты кальция предотвращают свертывание. Высокие концентрации ЭДТА являются гипертоническими к эритроцитам, поэтому если производится забор небольшого количества крови (например, 0,5 мл) и ее помещают в стандартную 5 мл EDTA пробирку, эритроциты будут сворачиваться. Редко контакт крови в ЭДТА может привести к связыванию антител в плазме крови животного с тромбоцитами и эритроцитами. Следствием связывания антител с тромбоцитами является агрегация тромбоцитов (превращение их в комок), в результате чего в анализе будет допущена ошибка из-за ложного снижения количества тромбоцитов. При связывании антител с эритроцитами, эритроциты агрегируют, имитируя агглютинацию , которая является ключевым моментом для диагностики иммуноопосредованной гемолитической анемии. В этом случае это является артефактом, но может привести к ошибочной диагностике иммуноопосредованной анемии ( Schaefer и др., 2009 ). Связывание ЭДТА-зависимых антител с тромбоцитами и эритроцитами может быть преодолено путем сбора крови в цитрат, однако рутинный сбор крови в цитрат не рекомендуется по причинам, указанным ниже.

• Цитрат: этот антикоагулянт также способствует образованию хелатных комплексов кальция, но более слабый, чем ЭДТА. Кровь разводят цитратом 10% (1 часть цитрата на 9 частей крови), поэтому все результаты будут ниже, по крайней мере, на 10% по сравнению с кровью, собранной в ЭДТА. Тем не менее, исследование тромбоцитов собак показало, что в образцах цитрата по сравнению с ЭДТА, количество тромбоцитов по - прежнему недооценивается, даже принимая во внимание эффект разбавления 10%. (Stokol и др., 2007).

• Гепарин: не рекомендуется для гематологических исследований. Лейкоциты часто превращаются в сгусток, взаимодействуя с гепарином, что влечет за собой ошибочные результаты. Гепарин также вводит окрашивающий артефакт (мазки выглядят ярко-розово-фиолетовыми), что влияет на исследование мазка.

Артефакты

Артефакты в образцах крови для исследования могут возникать из-за неправильного отбора крови, хранения, старения образцов, неправильного с ними обращения или неправильного окрашивания. Основные артефакты связаны с проблемами во время отбора проб. Наиболее распространенными проблемами являются:

• Трудности венепункции: Медленные или травматичные венепункции (прокол вены в нескольких местах или прокол ее насквозь, выход из вены во время отбора пробы) могут ускорить агрегацию тромбоцитов и вызывать появление небольших микросгустков в образце или даже свертывание образца. Свертывание образца снизит количество тромбоцитов и исказит результат. Также микросгустки могут нарушить работу гематологического анализатора, что приведет к неисправности машины.

• Малый объем образца: Сбор небольшого объема крови (например, 0,5-1 мл) с помещением его в стандартную 5 мл EDTA пробирку вызывает сморщивание эритроцитов, потому что ЭДТА является гипертоником. Это вызывает ложное уменьшение среднего объёма эритроцитов (MCV) и ложное увеличение средней концентрации клеточного гемоглобина (МСНС). Зазубренность эритроцитов (формирование эхиноцитов) также будет видно на мазке крови. Это обычный артефакт, который мы видим в гематологических образцах. Если получают настолько малый образец крови, предпочтительно использование микротейнеров , содержащих ЭДТА. В этом случае так же важно не забыть тщательно перемешать кровь, аккуратно переворачивая пробирку несколько раз.

• Плохое смешивание образца с антикоагулянтом: Кровь должна быть тщательно перемешана с антикоагулянтом во время или сразу же после взятия пробы. Недостаточное перемешивание приведет к свертыванию образца и появлению микросгустков, которые не могут быть видны невооруженным глазом.

• Разбавление с жидкостями: Сбор крови для гематологического исследования через катетер не является оптимальным, но может оказаться необходимым в критическом состоянии пациента, кровь которого в настоящий момент отбирается для постоянного мониторинга изменений. В идеале катетер следует промыть стерильным физиологическим раствором (чтобы удалить любые ранее вводимые внутривенно жидкости) и первые 3 мл крови следует слить, чтобы избежать эффекта разбавления.

• Грубое обращение: встряхивания пробирки, вбрызгивание крови в пробирку через иглу, неаккуратная транспортировка – все это может вызвать гемолиз.

Хранение образца. Артефакты

Хранение крови может привести к большому количеству изменений, ведущих к ложным результатам. Эти изменения сводятся к минимуму (но не устраняются полностью) путем хранения образца в холоде (холодильники, пакеты со льдом). Убедитесь в том, что мазки хранятся при комнатной температуре и не хранятся в холоде или в непосредственном контакте с контейнерами холода, т.к. мазок может замерзнуть или стать влажным, что приведет к искажению клеток.

Старый мазок, более 48 часов.

Артефакты обработки образца могут значительно ухудшить качество исследования крови, но этого легко избежать. Если предполагается задержка в анализе, например, закрыта лаборатория, мазки должны быть сделаны и отправлены вместе с ЭДТА пробиркой. Высушенные на воздухе нефиксированные мазки хранятся очень хорошо, если не подвергаются воздействию влаги и других факторов окружающей среды.

Артефакт. Влага.

Хранение крови в пробирке приводит к старению образца и к изменениям во внешнем виде клеток на окрашенных мазках крови. Со временем клетки полностью изменят свой вид, что сделает образец бесполезным для анализа.

Новый/старый мазок

Возрастные изменения, которые происходят:

• Эритроциты: зазубренность (образование эхиноцитов), лизис (это приведет к снижению количества эритроцитов и HCT, что приводит к ложно высоким MCH и МСНС), кристаллизации гемоглобина. Эритроциты также набухают при хранении (впитывают воду). Это приводит к ложно повышенному среднему объему клеток (MCV) и снижению средней концентрации клеточного гемоглобина (МСНС). Поскольку НСТ зависит от MCV, НСТ может быть выше, чем обычно.

• Лейкоциты: пикноз ядер, выраженность телец Доли (имитирующая токсические изменения). Пикнотические лейкоциты похожи (и могут быть неверно истолкованы) на ядросодержащие эритроциты . Эти изменения могут уменьшить число видимых лейкоцитов и существенно повлиять на дифференциальный подсчет клеток. Иногда изменения настолько серьезны, что точный подсчет различных клеток не может быть выполнен.

• Тромбоциты: агрегации, дегрануляции (тромбоциты трудно увидеть и пересчитать). Слипание тромбоцитов уменьшает их общее количество и увеличивает их средний объем (MPV), так как небольшое скопление тромбоцитов рассматривается как один большой тромбоцит. Большие сгустки тромбоцитов исключаются из подсчета в целом.

Артефакты окраски

Diff-Quik, Hemacolor – это обычно использующиеся в гематологии и цитологии быстрые красители. При правильном использовании и хранении они обеспечивают хорошее качество окрашивания.

• Когда краситель не используется, его нужно хранить под плотной крышкой: Это предотвращает испарение, минимизирует загрязнение растворов, а также предотвращает проникновение воды, воздуха и пр.

• Не доливайте растворы: Когда уровень жидкости или качество окрашивания снижается, опустошите, вымойте и высушите банку и только тогда налейте свежий раствор.

• Вода: Преломляющий артефакт, который является результатом присутствия воды в фиксаторе. Это обычно происходит при использовании плохо разведенных красителей. Вода преломляет свет и при микроскопии в одной плоскости пятно будет казаться светлым, в другой – темным. Такой артефакт часто ошибочно принимают за какое-то включение в эритроцитах, например, за паразитов (гемотропные микоплазмы).

• Осадок: Это обычно является результатом использования старых красящих растворов и/или недостаточной промывкой мазков после нанесения красителя.

#гематология #самообучение